Illumina-DNA&RNA共建库试剂盒

产品介绍

Illumina-RNA&DNA共建库试剂盒是Illumina测序平台的DNA&RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA反转录试剂,常规dscDNA合成试剂,DNA片段化试剂,接头连接试剂,以及文库扩增试剂。本产品利用专业开发设计的新一代片段化酶可以完成DNA和RNA一管式建库,简化了操作流程,极大的降低了建库时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于mNGS样本,肿瘤样本,复杂样本等的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

 

产品优势

■  利用专业开发设计的新一代片段化酶可以完成DNA和RNA一管式建库,简化了操作流程,极大的降低了建库时间和成本。
■  文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。

 

产品组分

 

名称

96T

dT23VN

96 μl  

Random Primer

96 μl

1st Reaction Buffer

768 μL

1st Strand Enzyme Mix

192 μL

2nd Reaction Buffer

288 μL

2nd Strand Enzyme Mix

960 μL

Smearase Enzyme Mix 480 μL
Ligation Enhancer 2×1440 μL
Novel T4 DNA Ligase 480 μ
2×Super Canace 1200 μL
Primer Mix 480 μL

 

注意事项

1.运输与保存方法:干冰运输。-20℃保存。有效期1年。


2.关于操作
■  为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
■  请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
■  推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
■  请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
■  PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。
■  本产品仅作科研用途!


3.关于接头连接(Adapter Ligation)
■ 试剂盒标配接头:Index Kit V2 for Illumina。
■  我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。
■  使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。
■  建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的DNA或者RNA投入量,参考表1,表2对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM,接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。


表1. Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表

 

Input Total RNA

Adapter stock concentration

10 ng

1 μM

100 ng

1.5 μM

500 ng

3 μM

≥1 μg

5 μM

 

表2. Input Total DNA量与接头使用浓度推荐表

 

Input Total DNA

Adapter stock concentration

1μg~200 ng

15 μM

100 ng

10 μM

500 ng

5 μM

10 ng

3 μM
5 ng 1.5 μM
1 ng 1 μM

 

4.关于文库扩增(Library Amplification)
■  本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真 DNA 聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。
■  如果您使用 Indexed Adapter(也称为长接头、大 Y 接头),可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增;如果使用的是“短接头”或者叫“小 Y 接头”,则需要使用 Index Primers 进行扩增,加上相应的 Index。
■  文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果


5.DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
■  建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用th DNA Selection Beads (th Cat#)进行DNA纯化和分选。
■  磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
■  磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
■  转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
■  磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
■  产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
■  DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。


6.关于文库质检(Library Quality Analysis)
■  通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
■  文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
■  推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
■  文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
■  文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

操作流程