Illumina-RNA建库试剂盒

注意事项

1.关于运输与保存方法：干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

2.关于操作
■  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
■  请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
■  推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
■  请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
■  PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
■  本产品仅作科研用途！

3.关于接头连接 (Adapter Ligation)
■ 试剂盒标配接头：Index Kit V2 for Illumina。
■  我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
■  使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
■  建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表
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4.关于文库扩增 (Library Amplification)
■  本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
■  如果您使用 Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用 Index Primers 进行扩增，加上相应的 Index。
■  文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。
■  表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
 

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

5.DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
■  建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用DNA Selection Beads (tn Cat#12601)进行DNA纯化和分选。
■  磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
■  磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
■  转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
■  磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
■  产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
■  DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

6.关于文库质检 (Library Quality Analysis)
■  通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
■  文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
■  推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
■  文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
■  文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

操作流程