MGI-RNA建库试剂盒
产品介绍
MGI-RNA建库试剂盒是用于MGI®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含RNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品优势
■ 宽广的起始量兼容范围，Total RNA起始量范围10 ng-1 ug，且在不同起始量下文库均有出色、稳定的数据表现。
■ 广泛的样本类型，兼容多种物种的多类型样本，包括人、动物、植物等多物种完整或轻微降解RNA样本、以及FFPE样本。
■ 出色的数据质量，转录本覆盖率高，全面、准确。
■ 优异的覆盖均匀性，高度均匀的覆盖转录本5’端至3’端，优异的3’端覆盖度。
■ 简便的操作，操作流程简化，建库仅需7小时，且可适配自动化建库仪。
■ 灵活的使用类型，可搭配不同RNA富集方法及不同测序读长，适合于各种样本类型与项目的需求。
产品组分
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名称 |
96T |
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DNA Damage Repair Enzyme |
192μL |
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End Prep Buffer |
960μL |
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End Prep Enzyme |
480 μl |
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Rapid Ligation Buffer 2 |
4 × 600 μl |
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Rapid DNA Ligase |
480 μl |
| the HiFi Amplification Mix |
4 × 600 μl |
| PCR Primer Mix 3 for Illumina | 480 μl |
| Control DNA (264 bp,50 ng/μl) | 10 μl |
注意事项
1.关于运输与保存方法：干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
2. 关于操作：
■ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
■ 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
■ 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
■ 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
■ PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
■ 本产品仅作科研用途！
3.关于接头连接（Adapter Ligation）
■ 试剂盒标配接头：th Complete Adaper Kit for MGI。
■ 我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
■ 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表
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可根据不同类型total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量
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【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
4.关于文库扩增（Library Amplification ）
■ 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
■ 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
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【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
5.DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）
■ 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用碳华DNA Selection Beads (碳华 Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
■ 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
■ 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
■ 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
■ 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
■ 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
■ DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
6.关于文库质检（Library Quality Analysis）
■ 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
■ 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
■ 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
■ 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
■ 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
操作流程
