Illumina-DNA建库试剂盒
产品介绍
Illumina-DNA建库试剂盒是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本的建库。改进版试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连。同时，替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。
产品优势
■ 末端补平，磷酸化，加A一步完成。
■ 不需纯化，直接加接头。
■ 超保真扩增，最大程度上降低了扩增偏好性。
■ 支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。
产品组分
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名称 |
96T |
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DNA Damage Repair Enzyme |
192μL |
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End Prep Buffer |
960μL |
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End Prep Enzyme |
480 μl |
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Rapid Ligation Buffer 2 |
4 × 600 μl |
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Rapid DNA Ligase |
480 μl |
| the HiFi Amplification Mix |
4 × 600 μl |
| PCR Primer Mix 3 for Illumina | 480 μl |
| Control DNA (264 bp,50 ng/μl) | 10 μl |
注意事项
1.关于运输与保存方法：冰袋运输。所有组分-20 °C保存，有效期1年。
2.关于操作
■ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
■ 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
■ 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
■ 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
■ 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
■ PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
■ 本产品仅作科研用途！
3.关于DNA片段化
■ 本试剂盒兼容范围为500 pg - 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。
■ 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在TE (10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0)中进行片段化。
■ 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表5，本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本，酶切时间参考表6。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。
■ 为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。
4.关于接头连接 (Adapter Ligation)
■ 试剂盒标配接头：Index Kit V2 for Illumina。
■ Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。
表1 500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度
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【注】：Input DNA摩尔数 (pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度 (bp)]。
5.关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
■ DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。
■ 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。
■ Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。
■ 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
■ 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
■ 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
■ 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
■ 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
■ 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
■ DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1个月。
6.关于文库扩增 (Library Amplification)
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1 μg文库的推荐循环数。
表2 500 pg-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表
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注：上表为使用高质量的Human gDNA构建文库使用的循环数参数。当DNA质量较差或需要进行长度分选，则参照较高循环数进行文库扩增。
7.关于文库质检 (Library Quality Analysis)
■ 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
■ 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
■ 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
■ 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。
■ 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
DNA建库流程示意图
