好文摘译丨核酸质谱快速检测结核分枝杆菌耐药性的临床效用

期刊：《International Journal of Infectious Diseases》

IF：8.4

结核病仍是发展中国家面临的全球卫生严重威胁之一，每年有1000万新发结核病患者，近150万人因结核病死亡。因此结核病也被称为“世界头号传染病杀手”。结核病的治愈需要经过数月至数年的漫长治疗，抗结核药物使用不当可能会延迟治疗进展、甚至使病患获得性耐药。准确快速诊断结核分枝杆菌（MTB）及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。

目前市场不同商用试剂盒对抗结核药物、耐药基因的覆盖度存在一定差异，且可能会将同义突变错误地报告为耐药。

本研究以表型药敏试验作为金标，核酸质谱在结核耐药预测表现如下：在8种抗结核药物中的平均一致性约为91.3%；对于利福平、异烟肼与阿米卡星，核酸质谱耐药检测的灵敏度与特异性均＞90%。在一定程度上，可为核酸质谱在结核分枝杆菌耐药检测中的临床应用提供依据。

从上海市肺科医院临床实验室保存的菌株（2019年1月至9月、2020年4月）中，随机挑选利福平耐药菌株115株、利福平敏感菌株53株。这些菌株后被鉴定为：对一线治疗药物——利福平、异烟肼和乙胺丁醇；二线治疗药物——链霉素、氧氟沙星、阿米卡星、环丝氨酸、乙酰胺、卡那霉素、莫西沙星、氨基水杨酸和利福布汀，具有耐药性。

以肉汤微孔板法进行药物敏感性试验，在7-10天时检查生长状况。若菌株在10日后仍生长不佳，则再孵育11天。以美国临床与实验室标准化研究所（CLSI）、美国食品药品监督管理局批准的AST标准，作为结核分枝杆菌的药敏拐点依据。

核酸质谱的技术原理流程图，如下所示（图1）。

当核酸质谱与药敏试验结果不一致时，进一步进行sanger测序。

在MedCalc软件中进行统计分析。以表型药敏结果作为金标准，计算核酸质谱法检测的一致性、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值（95%置信区间）。

在168个临床分离株中，98个来自最初接受治疗的患者，其余来自再次接受治疗的患者，确诊为耐多药结核病（MDR-TB）患者比例为59.5%。

AST实验结果表明：69%的结核病患者对至少一种药物产生了耐药性，68.5%的病患对至少一种一线抗结核药物耐药。

总耐药率如下：

在168个临床分离株中，56个分离株未发生耐药性相关突变，在剩下的112个分离株中，检出的总耐药率如下：

此外，通过核酸质谱在8个分离物中同时检测到了野生型和突变型变体。提示核酸质谱具有检测耐药异质性的前景。

以基于培养的药敏试验作为金标准，评估了核酸质谱预测8种抗结核药物耐药性的性能。

168株分离株中，核酸质谱对8种药物耐药预测的平均一致性为91.3%（范围：79.2%（乙胺丁醇）~99.4%（阿米卡星））。

对各种结核治疗药物的灵敏度和特异性如下：利福平的灵敏度和特异性分别为92.2%和100.0%；异烟肼为90.9%和98.6%；乙胺丁醇为71.4%和81.2%；链霉素为85.1%和93.1%；阿米卡星为94.0%和100.0%；卡那霉素为77.8%和99.3%；氧氟沙星为75.0%和93.3%；莫西沙星为75.0%和93.3%。

对利福平、异烟肼、阿米卡星和卡那霉素耐药预测值＞90%；对于乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星和莫西沙星的药物敏感预测值＞90%。

65株分离株在核酸质谱与表型药敏试验（基于培养）中对单药或多药的耐药结果不完全一致，使用sanger测序进行进一步分析原因。

尽管利福平耐药基因在不同地理区域突变率差异很大，但超过96%的利福平耐药是在rpoB基因的81bp“利福平-耐药基因决定区”发生突变所导致。在相关研究中，rpoB密码子531、526和516被证实为最常见的密码子突变，而密码子433 TTC插入、441(TCG>TTG)、433缺失、434缺失并不常见。本次试验设计中并不包含这些非常见突变，故引起4例核酸质谱对利福平耐药结果的误判。

在乙胺丁醇耐药中，embB306突变最为常见。embB基因密码子306 (ATG>ATA)、 306 (ATG>ATT)和406 (GGC>GCC) 可见于乙胺丁醇敏感株与耐药株中；同时，在链霉素耐药里，rpsL基因43位密码子突变最为普遍，但这种突变也会发生在链霉素敏感的菌株中，可能导致了基因型与表型不一致的现象。

此外，有研究表明，药敏试验可能会降低低水平耐药的异烟肼、利福平、乙胺丁醇耐药性，这可能也是导致核酸质谱与药敏试验结果存在差异的原因之一。

本实验已证明核酸质谱法可用于MTB的药敏快速检测，除乙胺丁醇（79.2%）外，其余药物耐药结果与表型药敏试验的一致性均超过85.0%。对于利福平、异烟肼和阿米卡星，核酸质谱耐药检测的灵敏度和特异性均>90.0%，其性能与Xpert MTB/XDR和GenoType MTBDRsl不相上下。此外，核酸质谱还可检测分离株的耐药异质性。一项研究显示，4.8%的临床分离株具有耐药异质性。这或将提示，在临床高度怀疑菌株具有耐药异质性时，可进行核酸质谱耐药检测。

总而言之，核酸质谱有望成为快速检测结核耐药性的有力工具。