诊疗方案丨SCAP患者肺泡灌洗液宏基因组测序结果临床判读指导原则
重症社区获得性肺炎(severe community-acquired pneumonia，SCAP)患者病死率为25%~50%，超过一半的SCAP患者无法通过常规检测得到病原学诊断。
宏基因组测序(mNGS)已逐渐成为最有应用前景的病原学分子诊断技术之一，被广泛应用。然而，mNGS的测序及生物信息分析技术并无统一标准。
注重mNGS结果与临床特征相结合的解读模式是本文的核心观点。
本原则将基于SCAP的临床诊断思路，对细菌、病毒、真菌、非典型病原体（包括军团菌、支原体、衣原体）及寄生虫分别进行阐述，以确定所检出微生物是致病、定植或是污染。
检出微生物分类总览表格
01
细菌
参照文献资料及临床实践中微生物检出情况，下文列出mNGS检出结果中常见致病细菌、机会性致病细菌及定植细菌，可能有特殊临床意义的细菌单独阐述。
常见致病菌
mNGS对SCAP常见致病细菌的检出敏感度较高，结果为阴性时，有较好的阴性预测价值，结果为阳性时，亦有定植或污染可能，尽量结合BALF的涂片检查进行综合判断。
包括：
肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、结核分枝杆菌、卡他莫拉菌等。
机会性致病菌
此类细菌一般情况下不会引起感染，当患者存在免疫功能低下、呼吸道屏障功能破坏或下呼吸道微生态失衡时，亦可导致肺部感染。因此，当mNGS检出以下细菌时，需要结合临床情况，尤其是宿主的免疫状态进行分析判断。
包括：
咽峡炎链球菌群（包括星座链球菌、中间链球菌）、化脓性链球菌、柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、放线菌属、纹带棒状杆菌、副流感嗜血杆菌、皮氏不动杆菌、解甘露醇罗尔斯顿菌、惠普尔养障体等。
定植细菌
此类细菌是下呼吸道正常微生态菌群，一般不导致感染，但存在经误吸引起肺脓肿的可能。如存在误吸高危因素，临床表现符合肺脓肿，同时涂片染色证实标本合格亦发现此类细菌时，可考虑致病可能。
包括：
普雷沃菌属、弯曲菌属、韦荣球菌属、葡萄球菌属、奈瑟菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属、普氏杆菌属、龋齿罗氏菌、痤疮丙酸杆菌、微小变形杆菌、产氧克雷伯菌、变种克雷伯菌、异栖克雷伯菌、微小微单胞菌、副乳杆菌干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、微嗜氧戴阿李斯特菌、副血链球菌、流行嗜血杆菌、草绿色链球菌、假白喉棒杆菌等。
敏感性较低的细菌
部分细菌核酸提取困难，检出敏感度较低。此类细菌即使mNGS检出序列数较低，也不能除外致病菌的可能，需结合临床谨慎判读。
01 诺卡菌
诺卡菌是条件致病菌，可导致肺部感染，临床表现不典型，诊断以病原学结果结合宿主高危因素为主。既往常规病原学检测难以检出诺卡菌，其感染率及致病力可能被低估。相对常规检测方式，mNGS对诺卡菌的检出有一定的优势，但也存在环境污染可能，需结合临床谨慎诊断。
02 分枝杆菌
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌在下呼吸道不存在定植可能，一旦检出，即需要考虑感染可能。可将mNGS视为结核分枝杆菌的分子生物学检查之一，参照我国肺结核诊断标准(WS 288-2017)进行诊断。如若临床怀疑结核感染，即使mNGS结果阴性，也不能除外感染可能，需联合抗酸染色涂片、培养及GeneXpert等其他检查手段。
非结核分枝杆菌
非结核分枝杆菌大部分为寄生菌，仅少部分对人体致病，属条件致病菌。mNGS结果可视为非结核分枝杆菌的分子生物学检测之一，但也存在环境污染可能，需参照临床指南，符合1次BALF培养和（或）分子生物学检测阳性可诊断为NTM肺病。
03 布鲁氏菌
布鲁氏菌可导致人畜共患的自然疫源性传染病。mNGS如检出布鲁氏菌，应充分重视，但也存在环境污染可能。如满足临床表现及流行病学史，可完善布鲁氏菌特异性血清凝集试验，作为临床确诊依据。
需注意，布鲁氏菌感染需按照国家法定按传染病进行处置，并根据当地卫生行政部门制定的报告程序上报，同时做好相应的防范隔离措施。
04 鼠疫耶尔森菌
鼠疫耶尔森菌毒力很强并有高度传染性，即使mNGS检出1个序列数也需高度重视，按照国家法定传染病管理办法进行相应处置，尽快复核并采用其他方法验证。
02
病毒
病毒核酸易提取且核酸片段小，mNGS在病毒检出方面具有优势。需注意的是，如临床怀疑RNA病毒感染，需注意额外加做mNGS测序的RNA检测。
常见致病病毒
检出即考虑致病
新型冠状病毒、汉坦病毒
两种病毒皆不为呼吸道的定植病毒，若mNGS检出即考虑其致病。
序列数较多，考虑致病
流感病毒、腺病毒
若mNGS检出序列数较多，且符合临床表现，考虑其为致病病毒。若mNGS检出序列数较少，尽快完善其他传统病原学方法确诊
多为上呼吸道感染
鼻病毒、呼吸道合胞病毒
鼻病毒和呼吸道合胞病毒常引起上呼吸道感染，少数情况下可引起下呼吸道感染，极少引起SCAP。
mNGS若检出鼻病毒／呼吸道合胞病毒的同时，检出其他常见致病病毒或细菌，优先考虑其他常见微生物引起肺炎可能。
副流感病毒、人类偏肺病毒
呼吸道分泌物检测出上述病毒时，多考虑上呼吸道感染。长期居住于医疗照护机构者可出现严重的下呼吸道感染。
水痘－带状疱疹病毒
少数情况可引起肺炎，若mNGS检出水痘-带状疱疹病毒，宿主存在高龄、免疫抑制等情况，应尽快完善PCR及抗体相关检查，进一步明确其致病可能。
常见下呼吸道定植病毒
人群普遍携带，多不考虑致病，当患者为免疫功能抑制宿主时，需结合临床判断：
①单纯疱疹病毒1型
②人疱疹病毒6型
③人疱疹病毒7型
几乎不考虑致病：
EB病毒，几乎在所有成年人中表现为持续终身的无症状携带，成人呼吸道分泌物检测出EB病毒几乎不考虑致病。
无证据表明致病：
细环病毒，在健康成人血液中细环病毒的检出率约为70%~90%，目前无细环病毒致病的证据。
03
真菌
真菌是厚壁微生物，核酸提取较困难，mNGS检测真菌的敏感度相对较低。肺部真菌感染的诊断需要结合患者临床特征，尤其是宿主的免疫状态综合判断。
常见致病真菌
隐球菌
在环境中广泛存在，一般不发生呼吸道定植，致病力强，免疫正常宿主也可感染。mNGS检出隐球菌阳性时，一般考虑为致病菌，其中最常见的致病是新生隐球菌。
毛霉菌
毛霉菌感染常见于糖尿病、血液系统恶性肿瘤、实体器官或造血干细胞移植及其他免疫功能低下的患者，mNGS检出阳性时，需高度警惕。
条件致病真菌
可在正常人体呼吸道检测到，mNGS回报阳性时，应谨慎考虑。
包括：
曲霉菌、耶氏肺孢子菌
定植真菌
念珠菌
念珠菌，常见的呼吸道定植微生物，mNGS检出阳性一般也不认为是致病原，诊断肺部念珠菌感染应十分谨慎。
04
非典型病原体
非典型病原体的概念主要是为了与经典的细菌性肺炎相鉴别。时至今日， 非典型病原体已成为SCAP重要的致病原之一， 且多数可引起多系统并发症， 导致患者预后更差， 需高度重视。
军团菌
国内该病导致的SCAP并不少见。mNGS检测军团菌的敏感度和特异度均较高，阳性结果需引起重视，但要先排除环境污染可能。通常有1/100万序列数即可考虑，随着序列数增加，其可信度逐渐增加，但达到30/100万时，其增量不再有增加可信度的意义。
肺炎支原体／肺炎衣原体
肺炎支原体和肺炎衣原体不是下呼吸道的定植微生物，mNGS技术在二者的检测方而较传统检测方法具有一定优势，一旦检出，即需考虑致病可能。
鹦鹉热衣原体
mNGS在鹦鹉热衣原体的诊断方面具有较大优势，若有相关流行病学史（鸟类或禽类接触史），即使序列数较低仍需要考虑致病可能。
05
寄生虫
目前寄生虫的基因组参考数据库种类不多，且寄生虫作为真核生物，有很多与人基因组相似的元件，因此在判断阳性时要特别要求序列的特异度。寄生虫作为阳性判断的阈值需在10/100万以上，并且需要严格确认序列的特异度之后再进行阳性判读。
06
小结
目前，人们对mNGS的认识尚有待于进一步规范。mNGS确实是敏感、快速的病原学检测技术，但不能完全取代常规病原学检测，应强调“平行送检＂。
同时，本着“宽进严出”的基本原则，在保证病原微生物高检出率的同时，临床医师要严格把控临床判读，避免过度诊断和治疗。
mNGS报告中常用术语
严格比对序列数(stringently mapped reads number，SMRN)：
又称序列数(reads)指特异且唯一匹配到该病原体基因组上的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。
标准化严格比对序列数(standardized stringently mapped reads number，SDSMRN)：
将SMRN标准化，即每两千万测得序列数特异且唯一比对到病原体基因组上的序列数目。
测序深度：
指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高，深度高低也反映病原体在样品中的相对含量。
基因组覆盖度：
指测序获得的序列与某物种的参考基因／基因组进行比对，序列覆盖的区域占基因／基因组总区域的比例。将能与基因／基因组比对上的序列碱基数累加并除以基因／基因组被覆盖区域的总长，即为平均测序深度。
相对丰度：
指的是该微生物在整个标本中检测到的相同类型微生物（细菌、真菌、病毒、寄生虫）中所占的比重，丰度越高表示其在相同类型微生物中所占的比例越高。
参考文献：
中国重症社区获得性肺炎研究协作组. 重症社区获得性肺炎患者支气管肺泡灌洗液的宏基因组测序结果临床判读指导原则[J] . 国际呼吸杂志，2023，43(1):7-14.
